糖基化是一类高度复杂且具有生物学功能的重要翻译后修饰，广泛参与细胞识别、信号传递、免疫应答等生命过程。定量糖蛋白质组学通过高通量质谱技术，解析糖蛋白的表达水平及其糖基化修饰位点，为疾病机制研究和临床标志物发现提供数据支撑。为了获得准确、可重复的分析结果，科学规范的实验流程与高质量的样本准备至关重要。本文将梳理定量糖蛋白质组学的标准化流程及关键操作要点，为研究人员提供实用参考。

一、定量糖蛋白质组学的核心流程

1、样本裂解与蛋白提取

在蛋白质组学研究中，样本的完整性决定了数据质量。糖蛋白质组学尤其对样本裂解条件敏感，推荐使用含蛋白酶及去糖酶抑制剂的裂解缓冲液，确保糖基化修饰不被降解或脱落。裂解后进行高速离心，去除杂质，提取上清用于后续分析。

2、蛋白定量与质量评估

使用BCA法或其他兼容的定量方法测定蛋白浓度，确保每个样本的蛋白总量在可比范围内（建议100–300 μg）。通过SDS-PAGE评估蛋白降解情况，确保样本完整性。

3、蛋白酶解

将总蛋白还原、烷基化后进行酶解，常用胰蛋白酶，可视样本性质联合使用Lys-C等内切酶以提高酶解效率与覆盖度。酶解时间、温度及酶与底物比例需严格控制，以获得稳定的肽段体系。

4、糖肽富集

糖肽在复杂样本中丰度较低，需采用高选择性的富集方法。常见策略包括：

• 亲水相互作用色谱（HILIC）：适用于整体糖肽的广谱富集；
• 凝集素亲和捕获（Lectin enrichment）：用于识别特定糖结构；
• 金属氧化物亲和材料（如TiO₂、ZrO₂）：可富集唾液酸化或O-GlcNAc修饰肽段。

※ 富集过程对缓冲体系、pH值及洗脱条件高度敏感，应根据样本特性进行优化。

5、定量策略

定量方法主要分为两类：

• 标记法：如TMT、iTRAQ等，适用于多组样本并行分析，提升实验通量；
• 无标记法：通过肽段峰面积进行相对定量，适合样本量受限或不易批量标记的实验设计。

※ 标记法要求严格控制反应时间、温度及pH，避免反应不完全导致定量误差。

6、LC-MS/MS分析

使用高分辨液相-质谱平台进行糖肽的分离与检测。鉴定糖基化修饰通常需结合HCD、ETD或EThcD碎裂模式，提升糖基化位点的解析准确性。质谱参数需针对糖肽特性优化，防止糖链丢失或信号干扰。

7、数据分析与功能解析

利用专业软件进行糖肽谱图解析与定量比对，输出糖基化位点、肽段丰度、表达差异等关键数据。结合数据库（如UniProt、GlyGen）与生物信息学工具进行GO、KEGG、Motif等富集分析，辅助理解糖基化的调控功能及其在病理状态中的潜在作用。

二、样本准备的操作要点

1、生物样本的采集与保存

• 组织样本应迅速液氮冷冻，细胞样本需冷PBS清洗后立即裂解；
• 血清/血浆样本建议去除脂质及细胞碎片，避免高背景干扰；
• 所有样本保存温度建议低于−80°C，避免反复冻融。

2、杂质去除与缓冲体系选择

• 对于脂类或盐离子含量高的样本，建议加入蛋白沉淀步骤或使用超滤浓缩进行纯化；
• 裂解液应兼容酶解、富集与标记过程，避免含有干扰组分（如SDS、EDTA等）。

3、酶解效率与肽段质量控制

• 推荐采用双酶策略（如Lys-C+Trypsin）增强消化效率；
• 监测酶解完整性可通过质谱预跑或SDS-PAGE快速评估。

4、富集条件的精细调控

• 控制肽段上样量、洗脱体积及缓冲pH，提升目标糖肽的富集特异性；
• 富集材料预处理与再生方式需标准化，确保批间一致性。

5、标记反应的质量控制

• 所有样本应在相同批次内完成标记，避免批次效应；
• 反应结束后及时进行过量试剂的清除，防止下游干扰。

三、数据质控与常见问题优化

高质量的数据依赖于全过程质控体系：

※ 建议在分析前设置技术重复，评估CV值以判断数据可靠性。对高置信度糖基化位点，可进一步通过靶向验证提高生物学解释力。

定量糖蛋白质组学是一项对操作细节和数据准确性要求极高的实验技术，其成功依赖于标准化的样本制备流程、精准的糖肽富集策略和高质量的质谱数据采集与分析。科研人员在实验设计与流程实施过程中，应根据研究目标合理选取定量方法、富集策略及数据解析工具，以最大化信息获取效率。百泰派克生物科技提供涵盖样本预处理、糖肽富集、标记定量、质谱分析到功能注释的一体化服务平台。结合先进的质谱设备与经验丰富的分析团队，我们致力于为您提供高通量、高灵敏度、可重复的糖蛋白质组学解决方案。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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